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人参皂苷Rb1相关研究发现,美国挪威人参皂苷代加工源头工厂为你带来!

来源:http://odm.nmnoem.com/news661049.html 发布时间:2021/8/6 10:05:00

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2021年1月1日,中国药科大学齐炼文教授在Theranostics发表研究论文“Proteomic analysis reveals ginsenoside Rb1 attenuates myocardial ischemia/ reperfusion injury through inhibiting ROS production from mitochondrial complex I”,研究揭示了挪威人参皂苷Rb1保护心脏免受I/R损伤的作用机制。

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, IR)损伤,也被称为再灌注损伤或复氧损伤,指因疾病或外在损伤造成局部组织缺血/缺氧,当血液返回缺血或缺氧组织时,对组织造成的损伤。
 
缺血后疏通血管或再造血管使组织得到血液的再灌注,本来是医师们的目的所在,但在一定条件下(取决于缺血时间)再灌注反而引起更加严重的后果。这不仅见于临床,而且也在不同种属(兔、大鼠、豚鼠、狗、猪等)的大量动物实验上被证明。研究逐渐发现,对组织造成损伤的主要因素,不是缺血本身,而是恢复血液供应后,过量的活性氧(Reactive oxygen species ,ROS)自由基攻击这部分重新获得血液供应的组织内的细胞造成的。
 
据报道,人参皂苷(ginsenoside)Rb1有保护心脏免受I/R损伤的作用,作者推测人参皂苷Rb1调控线粒体功能可能是其保护心脏免受缺血损伤的一种途径。因此作者通过蛋白质组学分析、siRNA敲低和酵母NADH脱氢酶的挽救分析等一系列实验对人参皂苷Rb1保护心脏免受I/R损伤的作用机制进行了研究。
 
? 人参皂苷Rb1减少再灌注时琥珀酸驱动的ROS的产生;

? 人参皂苷Rb1对活性氧的抑制可保护心肌细胞免受急性I/R损伤;

? 再灌注前给予人参皂苷Rb1有助于恢复过程中心脏功能的改善;

? 蛋白质组学揭示人参皂苷Rb1调控线粒体复合物I;

? 人参皂苷Rb1选择性地抑制线粒体复合物I的活性,但不抑制复合物II和IV的活性;

? 人参皂苷Rb1可逆地抑制线粒体复合物I的NADH脱氢酶;

? 人参皂苷Rb1控制线粒体复合物I的活性/失活性转变,以调节NADH脱氢酶活性。

 /解读/ 
 
● 人参皂苷Rb1减少再灌注时琥珀酸驱动的ROS的产生
 
原代成年小鼠心肌细胞中,缺氧-复氧(hypoxia-reoxygenation, H/R)损伤后线粒体ROS迅速增加,但经人参皂苷Rb1处理后ROS水平明显较低(图1A)。累积的琥珀酸(succinate)是再灌注时线粒体ROS产生的动力,实验发现琥珀酸可以促进大量ROS的产生,但人参皂苷Rb1预处理组降低了这一水平(图1B)。同时,人参皂苷Rb1可有效阻断再灌注早期线粒体ROS的产生(图1C),进而减轻氧化DNA损伤(图1D),甚至在14天和28天时仍保持这种效果(图1f)。

图1 人参皂苷Rb1减少再灌注时琥珀酸驱动的ROS的产生
 
● 人参皂苷Rb1对活性氧的抑制可保护心肌细胞免受急性I/R损伤
 
H/R损伤导致线粒体功能受损,表明MPTP的开放和原发性心肌细胞Δψm的崩溃(图2A-B)。人参皂苷Rb1可以减少细胞死亡(图2C),在I/R损伤前给药人参皂苷Rb1可以有效地减少心肌细胞凋亡(图2D),在缺血前和再灌注开始时给予人参皂苷Rb1均可显著减少梗死面积(图2E),然而,当再灌注15分钟后给药时,未观察到这种保护作用(图2E),表明及时干预对心脏保护至关重要。
 
图2 人参皂苷Rb1对活性氧的抑制可保护心肌细胞免受急性I/R损伤
 
● 再灌注前给予人参皂苷Rb1有助于恢复过程中心脏功能的改善
 
再灌注过程中ROS的产生是导致心脏功能受损和预后不良的原因。缺血前给药人参皂苷Rb1可以保护小鼠的心脏功能,并防止I/R损伤2周后的线粒体肿胀(图3A-B)。再灌注前给药人参皂苷Rb1可逆转心肌纤维化相关信号的上调(图3C),减轻I/R损伤28天后的心肌纤维化(图3D)。上述结果表明,再灌注前给予人参皂苷Rb1不仅可以减少急性心肌细胞损伤,而且还可以促进恢复过程中心脏功能的改善。
 
图3 再灌注前给予人参皂苷Rb1有助于恢复过程中心功能的改善
 
● 蛋白质组学揭示人参皂苷Rb1调控线粒体复合物I
 
由于线粒体ROS导致了再灌注损伤,从I/R损伤小鼠心脏中纯化线粒体,用于蛋白质组学分析。线粒体蛋白质级分中禁止素(prohibitin)的相对强度显著增加(图4A),线粒体蛋白在级分中具有很高的富集度和优势(图4B)。在591个显著改变的蛋白中,与假手术组(sham group)相比,I/R组有186例升高,405例下降(图4B)。PCA分析显示,I/R组与假手术组明显分离,人参皂苷Rb1处理部分逆转了蛋白模式(图4C)。
 
根据它们的变化趋势将这些差异蛋白分为4个簇(图4D)。人参皂苷Rb1处理组可以显著降低簇1蛋白含量,显著提高簇2蛋白含量。而对簇3和簇4蛋白则无显著影响。说明定位在1和2簇的蛋白被识别为人参皂苷Rb1的拯救蛋白或调控蛋白。这些蛋白的分子功能与氧化还原酶和NADH脱氢酶活性密切相关(图4E)。这些蛋白相互作用,并与氧化磷酸化和核糖体功能相关(图4F)。线粒体复合体I蛋白在心肌损伤时上调,但人参皂苷Rb1将其恢复到正常水平(图4F)。人参皂苷Rb1处理可显著拯救位于NADH脱氢酶(N模块)亚单位中的蛋白质(图4G)。综上所述,这些结果表明人参皂苷Rb1可能通过调节线粒体复合物I中的蛋白质来保护心脏免受I/R损伤。
图4 蛋白质组学揭示人参皂苷Rb1调控线粒体复合物I的机制
 
● 人参皂苷Rb1选择性地抑制线粒体复合物I的活性,但不抑制复合物II和IV的活性
 
人参皂苷Rb1尽管对基础OCR没有显著影响,但在不影响对抗霉素A不敏感的非线粒体O2消耗量的情况下,人参皂苷Rb1仍可显著抑制最大呼吸(图5A)。当丙酮酸和苹果酸作为底物时,人参皂苷Rb1处理抑制了心肌细胞中复合物Ⅰ依赖的O2消耗(图5B)。人参皂苷Rb1抑制了分离线粒体中线粒体复合物I的活性(图5C)。与鱼藤酮不可逆地抑制线粒体复合物I相反,从人参皂苷Rb1中洗涤出来可以恢复复合物I的活性(图5D),说明人参皂苷Rb1的抑制作用是可逆的。人参皂苷Rb1对线粒体复合物II、IV活性无影响(图5E-F)。综上所述,这些结果表明人参皂苷Rb1以可逆的方式特异性抑制线粒体复合物I的活性,但不抑制复合物II和IV的活性。
 
图5 人参皂苷Rb1选择性地抑制线粒体复合物I的活性,但不抑制复合物II和IV的活性
 
● 人参皂苷Rb1可逆地抑制线粒体复合物I的NADH脱氢酶
 
复合物I的NADH脱氢酶是ROS产生的候选位点。蛋白质组学结果表明,NADH脱氢酶亚基的不同蛋白水平在I/R损伤后发生改变。人参皂苷Rb1处理可以降低NADH脱氢酶亚基基因的表达(图6A)。在H/R条件下,NADH脱氢酶亚基的基因敲除降低了ROS的产生,保护了细胞活力(图6B-C)。在基础条件和H/R条件下,人参皂苷Rb1降低了心肌细胞线粒体复合物I的NADH脱氢酶活性(图6D-E)。从人参皂苷Rb1中洗涤出来可以恢复NADH脱氢酶活性,表明人参皂苷Rb1对复合物I的抑制是可逆的(图6F)。人参皂苷Rb1不能降低复合体I的替代分子Ndi1表达细胞的OCR(图6G)。同样,表达Ndi1的细胞抵抗了人参皂苷Rb1在H/R刺激下对ROS产生的影响(图6H)。Ndi1的表达加剧了ret介导的ROS的产生,并消除了人参皂苷Rb1的抑制作用(图6I)。这些结果表明人参皂苷Rb1的心脏保护作用可能是由于其对线粒体复合体I中NADH脱氢酶活性的抑制。
 
图6 人参皂苷Rb1可逆地抑制线粒体复合物I的NADH脱氢酶
 
● 人参皂苷Rb1控制线粒体复合物I的活性/失活性转变,以调节NADH脱氢酶活性
 
在I/R损伤中,线粒体复合物I的活性/失活性转变与ROS的产生高度相关。
通过一种放射性线粒体pH指示剂检测线粒体复合物I的活性,缺血状态下线粒体内pH较低,但再灌注时线粒体内pH升高(图7A)。人参皂苷Rb1处理使再灌注时线粒体内pH保持在较低水平,提示人参皂苷Rb1维持线粒体复合体I处于失活状态(图7A)。缺血或温度处理引起的构象变化导致临界Cys-39暴露于线粒体亚基ND3中,可以用巯基特异性试剂标记,作为线粒体复合物I失活的标记(图7B)。再灌注前给药人参皂苷Rb1保存了小鼠心脏ND3的暴露,进一步证实了人参皂苷Rb1对体内线粒体复合体I状态的影响(图7C)。表面等离子体共振技术确定人参皂苷Rb1对ND3表现出很强的结合亲和力(图7E)。这些结果表明人参皂苷Rb1可能通过与ND3亚基结合在复合物I中的失活构象来捕获酶。通过限制线粒体复合物I处于失活状态,人参皂苷Rb1处理在再灌注或再活化阶段使NADH脱氢酶活性降低(图7F)。
 
图7 人参皂苷Rb1控制线粒体复合物I的活性/失活性转变,以调节NADH脱氢酶活性
 
综上所述,人参皂苷Rb1通过降低NADH脱氢酶活性,将线粒体复合物I锁在失活状态,轻度、可逆地抑制线粒体复合物I,有助于减轻心肌再灌注损伤。这些发现不仅为人参皂苷Rb1保护心脏免受缺血损伤的机制提供了新的见解,而且提示调节复合体I中NADH脱氢酶活性可能是限制再灌注诱导线粒体ROS产生的潜在干预手段。


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 作者简介:
齐炼文

现任中国药科大学中药学院副院长,
“天然药物活性组分与药效国家重点实验室”课题组长。长期从事心血管代谢紊乱与药物干预研究,SCI刊源杂志上发表论文40余篇,同时担任多个国际杂志的编委。研究成果曾获国家科技进步二等奖”、“教育部自然科学一等奖”。

图源:本文所用图像均来源于论文

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